这种方法通过检测血液中与外泌体结合的Aβ,是否会记得约定、会议或约会呢

寻找老年痴呆的“蛛丝马迹”

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3月27日,中国科学技术大学申勇教授实验室联合多国研究小组在Biological Psychiatry期刊在线发表了一篇题为“Increased Plasma Beta-Secretase 1 May Predict Conversion to Alzheimer's Disease Dementia in Individuals With Mild Cognitive Impairment”的研究论文。研究发现,检测血液中β-分泌酶的活性可以在早期临床阶段,即轻度认知损伤状态的发生及发展。生物探索的记者就这一研究成果对申勇教授进行了专访。

图为张振馨正在进行流调

撰文 | 王承志

阿尔茨海默病,又称老年痴呆症,是一种与年龄有关的神经退行性疾病,该病表现为大脑认知功能减退,包括在发病初期症记忆力下降,情绪异常,并逐渐丧失生活自理能力,不仅病人痛苦不堪,也给家庭和社会带来沉重的负担。AD至今仍然无法预防,治疗及治愈。随着人类寿命延长,老年人口数增加,AD患者也越来越多。仅在美国,就有超过500万的人口罹患AD。许多患者在被确诊为AD时,疾病往往已经发展到中晚期。一些研究发现,AD患者在出现明显症状的十几年前大脑可能就已经发生认知、心理上的改变。因此,进行早期诊断和干预对于延缓阿尔茨海默病的发生、发展,减轻家庭、社会医疗负担具有重要意义。

“不用列清单,你能记得要买的一些物品吗?”

责编 | 陈晓雪

目前对阿尔茨海默病仍然缺乏有效的早期诊断方法。申勇教授表示,寻找AD早期的生物标志物是许多科研人员正在关注的焦点。除PET、核磁及认知、心理检测之外,更多人开始关注蛋白质或小分子。比如,一些研究试图在脑脊液中寻找疾病相关的蛋白或小分子。但是,这种创伤性的检测方式不容易被患者接受。而这项新研究在血液中找到了一种可能的AD生物标志物。

“你还能回忆起几天前的谈话吗?”

近来,新加坡国立大学助理教授 Huilin Shao 领导的研究团队发表了一种检测阿尔茨海默症(AD,俗称老年痴呆)的新技术,只需对病人的血液进行检测,一个小时便可得到结果。该技术有望在大量人群中对阿尔茨海默症进行筛查。1]

β淀粉样蛋白的异常聚集引起神经元损伤和认知功能减退,在AD发病过程中扮演着重要角色。Aβ由β淀粉样蛋白前体蛋白水解产生,BACE1是这一过程中的关键酶。BACE1在AD患者大脑的神经元中高度表达,被认为在AD病理和生理学中起着重要的作用。

“是否会记得约定、会议或约会呢?”

当前,全世界约有5000万阿尔茨海默症患者,但据 WHO 预测到2050年全球患病总人数会飙升至1.35亿,这可能是人类将要面临的最严重的健康危机之一。由于阿尔茨海默症在出现症状前有数年甚至数十年的潜伏期,因此如何早期诊断是医学界长久以来的难题之一。

申勇教授等人曾报道AD患者大脑和脑脊液中BACE1水平上升。这次在新研究中,研究人员从三个独立的国际着名AD或认知障碍研究临床中心及门诊分别招募了224名受试者:75名可能的AD患者,96名MCI患者和53名年龄、性别匹配的健康对照。申勇教授及研究团队发现,MCI和AD患者血液中BACE1蛋白表达水平及其酶活性均比对照组健康老年人显着升高。 而且,AD患者中BACE1活性的增加与AD临床认知量表,即简易精神状态检查表评测的严重程度有关——BACE1的酶活性与疾病严重程度成正比。申勇教授表示,MCI是AD早期阶段之一,但并非所有的MCI患者都会转化为AD。最令人惊喜的是,他们在研究中发现那些最终转化成AD的MCI患者血液中的BACE1酶活性更高,而没有转化成AD的MCI患者血液中BACE1酶活性相对较低。这意味着血液中BACE1酶的活性可以预测MCI是否会向AD转换。

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目前,阿尔茨海默症的诊断主要靠鉴定β-淀粉样蛋白的异常积聚。Aβ是细胞分泌的一种蛋白质,经水解后被分解一些短的片段,其中一些片段沉积在细胞基质中会对神经细胞产生毒性。当大量神经元死亡时即会产生老年痴呆的症状。

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这种一问一答式的对话,偶尔还要夹杂一些动手动脑的环节,持续时间整整两个半小时。询问者是北京协和医院神经内科主任医师张振馨,被询问者是一位刚刚从国企退休的干部。

当前,Aβ 的检测主要靠两种检测方法,一种是脑脊髓液样品检测,另一种是通过使用 PET 扫描仪的脑成像检测。前者是有创检测,后者花费很高,都难以进行大规模筛查。如何能够无创且便宜地检测异常积聚的 Aβ 是该领域的重点研究方向。

不同被试者BACE1酶活性及蛋白表达水平图片来源:参考文献

他们之间并不是普通的问诊,而是在进行“中国轻度认知损害和痴呆流行病学研究”的流行病调查。北京协和医院神经内科作为牵头单位,参与机构还有中日医院、煤炭总医院、北京医院、北医三院、天坛医院、安贞医院、火箭军总医院、华大基因等。

Shao 领导的研究团队发明了一种 Aβ 血液检测平台,命名为APEX(amplified plasmonic exosome,扩增的等离子体外泌体)。这种方法通过检测血液中与外泌体结合的Aβ,其结果与PET具有很好的相关性。

本研究的资深作者,皮埃尔和玛丽居里大学的Harald Hampel博士说:“我们的研究结果表明,BACE1活性可能成为一个用于早期检测,诊断和研究AD的新的生物标志物,并能成为追踪疾病发展的有力工具。BACE1 作为一个血液生物标志物也可以作为目前AD治疗中BACE-抑制剂试验结果,从而优化关键治疗试验的设计以增加它们成功的几率。”与利用脑脊液来诊断AD不同,通过检测血液生化改变来检测AD发展具有明显优势。申勇教授说,目前一些AD药物临床试验的失败的原因之一是由于缺乏一个客观指标来衡量药效,他们希望能BACE1 酶的活性能够成为一个可靠的药效学指标。

“通过这种入户一对一的流调,目的是探索防治阿尔茨海默氏病更有效办法。”张振馨在接受《中国科学报》记者采访时表示,阿尔茨海默氏病是一种慢性进行性神经退行性疾病,是一个连续统一的过程,分为临床前期(无症状但有病理改变)、轻度认知功能障碍期、痴呆期(痴呆期常被称为老年痴呆)。多发于60 岁以上老年人,早期多表现为记忆障碍,以近期记忆力受损为主,随着病情的进展,病人可出现分析判断理解能力、视空间能力和语言能力下降,行为异常以及日常生活不能自理等表现,给家庭和社会带来沉重的负担。

与检测脑脊液相比,血液中的 Aβ 蛋白浓度很低,实验表明其血浓度接近常用的ELISA 检测法( 酶联免疫吸附试验,一种检测血液中蛋白浓度的方法)的检测浓度极限,因此难以精确定量。并且,检测血液中的总 Aβ 蛋白与 PET 检测结果相关性很低,表明这种方法特异性很差。

谈到下一步实验计划时,申勇教授表示他们正在与全球多个AD临床神经科学研究机构进行合作,希望能更大规模重复这些数据。目前,研究小组每六至十二个月从AD患者或MCI被试者中收集血液和脑脊液样本,进行表型、基因型、生物标志物研究,同时临床评估他们的认知和行为症状。在接下来,研究小组将利用淀粉样蛋白PET成像技术纵向观察目前无症状的临床前风险人群。申勇教授说,通过300多人的纵向调查,这项研究将能够确定BACE1活性是否可以预测未来疾病发生、发展和转换为最早出现的临床症状以及脑功能下降率。他希望在不远的将来,这项研究成果能应用于临床。最后,申勇教授表示他们还在寻找更多的AD生物标志物,鉴于AD病理十分复杂,因此还需要更多的生物标志物来进行准确判断。

数据统计显示,2015年全球痴呆患者人数已达4680万人,其中50%~75%为AD患者。我国现有痴呆患者约为900万,其中痴呆期AD患者约有600万,已居世界第一,同时也是全球增速最快的国家/地区之一。

研究者猜测,总Aβ蛋白特异性低的原因可能是血液中特定类型的 Aβ 蛋白才与 AD 相关。经过筛选,研究者把目光聚焦到一种叫做外泌体的物质上。

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“但仅有少数患者得到了规范诊断。随着我国人口老龄化社会的到来,如果再没有有效的防控手段,2040年中国痴呆人数将等于世界发达国家痴呆人数的总和。”张振馨言语中有些焦急。

外泌体是细胞分泌到胞外的囊泡结构,它像一个集装箱,携带大量货物,在细胞间穿梭。不同的外泌体表面有不同的分子标记,就像集装箱上的收货单,通过这种方式被特定的细胞识别。

该研究主要由中国科技大学神经退行性疾病研究中心暨脑资源库的申勇教授,法国皮埃尔和玛丽居里大学的 Harald Hampel教授,瑞典哥德堡大学临床神经科学中心的Kaj Blennow,美国佛罗里达州罗斯坎特老年医学研究所李人教授以及美国Emory大学阿尔兹海默病研究中心的Allan Levey 教授等带领的联合研究小组共同完成。

发病重灾区,误失诊治良机

研究者首先确定了一些外泌体携带有 Aβ 蛋白。研究者使用纳米孔技术来捕获外泌体,并通过一种原位酶扩增的技术,将捕获到的外泌体信号放大,并运用表面等离子共振来进行检测。

“不少人误以为AD就是自然衰老,直到患者多次发生了‘走失’等严重情况后,家属才带其就医。”张振馨表示,不仅民众甚至连部分医师因检查方法的限制,对AD也存在认识误区。

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张振馨表示,在临床采用国际标准化认知和生物标志物的测查,能够实现早期精准诊断。2015年在其门诊就诊的阿尔茨海默氏病患者中,早期检出前驱期AD和轻度AD患者的比例较高。在各类痴呆中,易被误诊为AD的额颞叶萎缩的患者检出比高达21%以上。

图1:外泌体携带有Aβ蛋白。图片来源:参考文献1

“其实,AD是可以通过药物和非药物整合治疗,帮助患者改善认知功能。但由于有些患者往往已经出现严重的认知障碍和行为异常才去医院诊断治疗,此时已经萎缩的脑组织难以逆转。”张振馨说。

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鉴于此,全世界都寄希望于将AD的“诊断窗口前移”,在患者出现轻微症状,甚至是还没有出现症状的情况下进行早期的精准的诊断,这也是国内外研究AD的大趋势,甚至可以说是唯一的出路。

图2:纳米孔捕获外泌体与原位扩增。图片来源:参考文献1

而要想对AD实现早诊早治,首先应该摸清其发病机制。目前,医学界对于AD的发病机制主要有以下的学说:β淀粉样蛋白学说、tau 蛋白异常磷酸化学说、炎症假说。但尚未形成统一共识。

经过测试,这种被研究者命名为 APEX 的检测方法灵敏度比以前的 ELISA高了几个数量级。研究者们用 APEX 方法对84名受试者的血液进行了检测。其中有17名AD 患者,18名轻度认知障碍,16名无认知障碍的健康人,以及9名血管性痴呆和12名神经血管损害的病人。

“重要的是要找出更多从AD无症状期过渡到前驱期再到痴呆期的特异性强、敏感性度高、反映疾病不同表型、预警疾病恶化的生物标志物。”张振馨说,目前关于AD发病风险因素研究多集中在遗传与AD痴呆期的环境因素,但忽略了更具有病因意义的AD痴呆发病前的环境因素。

检测结果显示,外泌体结合的 Aβ 蛋白与认知程度呈显着的相关性,而未与外泌体结合的 Aβ 蛋白和血浆总 Aβ 蛋白没有显示这种相关性,这证实了研究者之前的猜测:特定类型的 Aβ 蛋白才与 AD 相关。

比如AD与女性、小血管病、肿瘤和肠道细菌种群的关系。

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大范围流调必不可少,受试者获益匪浅

图3:外泌体结合的Aβ蛋白与认知程度呈显着的相关性。图片来源:参考文献1

AD如此严峻的现实情况,也引起各国政府的关注。

为了便于大规模筛查,研究者将这种检测技术做成了生物芯片。每个芯片可以同时检测60个样本,并在1个小时左右得到检测结果。研究者对媒体表示,这种芯片很容易用于大规模筛查,目前该实验室正在和商业公司合作,争取5年内将该成果推向市场。2]

2011年,美国总统奥巴马就签署通过全美阿尔茨海默氏病计划法案,要求在美国开发一个全国性战略计划来解决阿尔茨海默氏病的危机并调整联邦政府工作。

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目前,我国相关部门相继启动了针对AD研究的专项课题,比如国家重点研发计划“重大慢性非传染性疾病防控研究专项”课题、北京市科技计划“北京脑科学研究”课题、“中国医学科学院医学与健康科技创新工程重大协同创新项目”等。

图4:可以同时检测60个样本的生物芯片。图片来源:参考文献1

而这些课题不约而同地都将AD作为重点研究对象,试图探索AD病因、发病机制及危险因素,以期发现和确认新的与家族性或散发性AD相关的致病或易感基因,并揭示其致病机制;研究遗传危险因素、老化和环境危险因素对AD的交互作用机制;研究这些危险因素在AD发生及进展中的作用;建立AD发病风险预测模型。但如何才能更好地实现课题的目标呢?

“本文中的诊断技术如果能够在临床上普及,应该能为阿尔茨海默症的早期诊断提供相当大的帮助。”致力于阿茨海默症防治方法的美国初创公司PEARL Labs的首席科学家沈颖捷博士评论说。

作为这几项承担课题的主要负责人张振馨认为,必须要将所有的课题进行统筹安排,选择一个有效且可行的办法,大范围的流调自然必不可少。

她指出,阿尔茨海默症的早期诊断的研发是和治疗方法的研发同样重要而且缺一不可的。“目前临床试验频频失败的诸多原因之一就包括缺乏精准的早期诊断,也就是在病人出现认知衰退的症状之前的精准而且低耗资的实用诊断方法。”

“老年疾病的流行病研究相对难度较大,尤其是样本采集更加困难。”为此,张振馨建立了以北京协和医院为核心,联合上海、西安、沈阳、重庆、武汉、苏州、杭州、福州等医院建立全国协作网络,选择固定的社区人群共5000人作为流调样本,以便回访开展进一步研究。

值得一提的是,6月底,瑞典隆德大学(Lund University)的研究人员与制药企业罗氏合作,也发表了另一种利用血液检测 Aβ 蛋白的方法,并将于今年秋季开展较大规模的临床试验 3]。

那么,具体的流调工作如何开展呢?张振馨认为,必须采用国际标准化的认知评估工具,对记忆力、执行功能、视空间能力及语言能力等不同认知域进行多维度的全面评估,进而进行全面评估AD相关危险因素。

沈颖捷进一步评论说,可靠性和敏感性强而且又能普及应用的早期诊断方法或许有可能让之前一些临床试验中失败的药物“起死回生”。“当然,如果我们对阿尔茨海默症的生物标记物(biomarker)的研发能够在生物信号通路上达到Aβ生成的更上游,将对疾病的预防和治疗提供更大的应用价值。”沈颖捷说。

为此,该团队骨干袁晶博士专程前往美国波士顿大学,学习国际最先进的认知测查法,并基于中国文化背景,进行了调整与创新,进而对于参与流调的每一名医师均进行严格培训指导,保证对老人的认知状态进行全面细致准确的评估。

参考文献:

值得称赞的是,此次研究与临床密切相关,不仅研究结果直接用于临床,整个研究过程服务于临床,许多医院做不到的中美专家联手进行的分子水平、神经回路与网络的高水准诊断都能在社区完成,受试者获益匪浅。

1]. Lim C Z J, Zhang Y, Chen Y, et al. Subtyping of circulating exosome-boundamyloid β reflects brain plaque depositionJ]. Nature communications, 2019,10: 1144.

多方位寻找“标记物”

2]

除了面对面的询问评估,流调更重要目的是对这些样本人群的血液指标、脑部影像学、基因片段进行甄别和监控,以期从中找到能作为AD早期诊断的标志物。

3]. Palmqvist S, Janelidze S, Stomrud E, et al. Performance of Fully AutomatedPlasma Assays as Screening Tests for Alzheimer Disease–Related β-AmyloidStatusJ]. JAMA neurology, 2019.

以血液指标为例,外泌体领域最近已成为研究的热点。北京大学第三医院病理科医生武睿告诉《中国科学报》记者,所谓的外泌体是一种直径为40~100nm的纳米级脂质包裹体结构,内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质,几乎所有类型的细胞都可能产生并释放外泌体。

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相关研究已证实,在外泌体中的确发现含有与AD相关的发生突变及错误折叠的Aβ和磷酸化tau蛋白。而这就意味着,通过检测血液中的外泌体中的AD相关的标志物能够对AD做出早期预警。

可喜的是,北京大学医学部章京实验室可以在传统Aβ和tau蛋白的检测基础上,创新性地通过分离血液中的外泌体,并运用国际最新的单分子计数技术,检测外泌体中的α突触核蛋白。这势必为提高阿尔茨海默氏病的诊断和早期预警能力再添一个有力“武器”。

“不管是Aβ和tau蛋白,还是α突触核蛋白,这些物质在血液中的检测与中枢系统来源的外泌体的富集都是难点。”武睿表示,即便是准确检测到了这些蛋白物质,还需要通过大规模人群的检测和统计,建构一定的公式或模型来确定早期轻度认知障碍人群血液中相关蛋白的基准值,精确计算这些蛋白的数量、比例与AD早期发生的关系,构建轻度认知障碍的综合诊断模型。

在基因测序与检测方面,“主要通过筛查AD人群的基因突变,并与健康人群进行大数据比较,从中发现相关位点的基因,进而指导AD预防与治疗工作。”华大基因的生物信息工程师刘汉奎在接受《中国科学报》记者采访时说。

刘汉奎提醒,疾病的发生不仅仅与基因突变有关系,还受到环境、饮食等诸多因素影响。“不过,一旦在流调过程中发现有家族史的AD患者,并且有明显的遗传模式与共分离的基因突变,则可以‘回过头’再去检测这个家族其他人的遗传信息,赶在发病前进行预测与预防。”

而对流调人群进行功能核磁共振检查,目的在于通过对大脑结构影像的信息采集,探测脑部神经网络的功能状态。

“最终,我们试图从分子、基因、神经回路与网络、脑的功能与结构等层面上精准地识别无临床症状的早期患者,进而在出现脑组织损伤前进行早期预防与治疗。”张振馨期望,在相关研究机构的协同合作下,寻找出真正提升AD的防治办法,让更多的中国老人受益。

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